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　　酶聯(lián)免疫(HRP)ELISA試劑盒技術(shù)資料

　　酶聯(lián)免疫(ELISA)通用試劑盒是一種通用的酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測抗原或抗體的試劑盒，含有 ELISA 實(shí)驗(yàn)所必須的通用試劑組份，對反應(yīng)條件、操作步驟、各試劑的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，保證了檢測結(jié)果的靈敏度和重復(fù)性。

　　蛋白檢測酶標(biāo)試劑盒可用于檢測小鼠、兔或人的抗體。適用于初次接觸 ELISA 技術(shù)的實(shí)驗(yàn)者，或者為節(jié)省時間并保證檢測結(jié)果具有高靈敏和可重復(fù)性的科研工作者。

　　1.試劑盒組分

　　1.1. 包被緩沖液(10×濃縮) 25ml ×1 瓶

　　1.2. BSA 稀釋液/封閉液(10×濃縮) 100ml ×1 瓶

　　1.3. 洗滌緩沖液((20×濃縮)100ml ×1 瓶

　　1.4. TMB 顯色液 100ml ×2 瓶

　　1.5. 終止液(10×濃縮) 25ml ×1 瓶

　　1.6. HRP 標(biāo)記抗體：1ml

　　1.6.1 HRP 標(biāo)記抗人 IgG (H+L) 0.1 mg

　　1.6.2 HRP 標(biāo)記抗兔 IgG (H+L) 0.1 mg

　　1.6.3 HRP 標(biāo)記抗鼠 IgG (H+L) 0.1 mg

　　儲存在 2～8°C，有效期 2 年，可以完成 20 塊 96 孔酶標(biāo)板檢測。

　　2.試劑盒不提供的試劑或耗材

　　2.1. 人、小鼠或兔的一抗

　　2.2. 親和層析純化的未標(biāo)記捕獲抗體

　　2.3. 酶標(biāo)板(不建議用組織培養(yǎng)板)

　　2.4. 吸水紙、毛巾或棉布

　　2.5. 蒸餾水或純化水

　　2.5. 移液器試劑瓶等

　　2.6. 多通道排槍和加液槽

　　2.7. 手套

　　2.8. 槍頭

　　3.檢測原理

　　3.1 雜交瘤篩選可以檢測雜交瘤培養(yǎng)液中的特異性抗體，使用適當(dāng)標(biāo)記二抗，可以檢測抗原特異性的人、鼠和兔抗體。

　　3.2 檢測抗原或抗體

　　3.2.1 直接 ELISA：是檢測抗原的簡單方法，包被抗原，加標(biāo)記的檢測抗體。

　　3.2.2 間接抗體 ELISA: 可以檢測抗原或抗體，取決于哪種是未知的。包被抗原，加一抗或含抗體的血清或腹水，常用于檢測動物特異性抗體的水平，也可用于檢測雜交瘤培養(yǎng)上清中的單克隆抗體。

　　3.2.3 雙抗體夾心法：是檢測抗原的一種高度敏感性的方法。用高度純化的抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，檢測抗體可直接標(biāo)記酶，如果包被抗體和檢測抗體不是來源同種動物，檢測抗體也可不標(biāo)記，而加針對檢測抗體動物種屬的酶標(biāo)二抗，此法適用于抗原濃度過低，不能直接包被到酶標(biāo)板上或者含有未知成分干擾的抗原檢測。

　　4.確定反應(yīng)條件

　　4.1 雜交瘤篩選

　　用間接 ELISA 方法篩選抗體

　　4.2 檢測抗原或抗體

　　按照推薦的方法和步驟可以滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的要求，反應(yīng)時間、溫度和試劑濃度等可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行調(diào)整每一步都應(yīng)該進(jìn)行系統(tǒng)性評價以便獲得最佳的實(shí)驗(yàn)條件。試劑通過倍比稀釋以確定最佳濃度。選擇合適的對照，以確定實(shí)驗(yàn)中存在的問題，發(fā)現(xiàn)引起錯誤結(jié)果和高本底的原因。確定實(shí)驗(yàn)方案和樣品數(shù)量后，可以準(zhǔn)備所需要的各種材料和試劑。實(shí)驗(yàn)前，建議所有的試劑恢復(fù)到室溫并混勻。4.3 檢測條件概述

　　4.3.1 包被酶標(biāo)板

　　多種包被條件：抗原或抗體濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度和孵育時間都影響包被效率。此外，結(jié)合蛋白的數(shù)量與分子量成反比。試劑盒中包被液為優(yōu)化的磷酸鹽緩沖液，適用于大多數(shù)抗原和抗體的包被。微孔板應(yīng)選擇專用于 ELISA 的酶標(biāo)板，不建議使用組織培養(yǎng)板。

　　包被時，抗原或抗體在包被緩沖液中稀釋后加入到酶標(biāo)板中室溫孵育，盡可能使用最純的抗原或抗體。一般來說 1～10μg/ml 室溫 1 小時能夠包被飽和。為方便，2～8°C過夜可以到滿意的包被效果。包被后，酶標(biāo)板用 BSA 稀釋/封閉液封閉 5 分鐘，稀釋/封閉液中含 1%BSA，能夠通過封閉未反應(yīng)部位減少非特異性結(jié)合并保護(hù)包被上的蛋白質(zhì)活性。如果暫時不繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，可以用塑料膜覆蓋酶標(biāo)板后冷藏保存，需要時再恢復(fù)室溫繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

　　4.3.2 洗板

　　加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體后需要洗滌，通過洗滌可以去掉未反應(yīng)試劑幫助降低本底。滿意的洗滌方法是孔與孔之見均勻一致并且沒有液體的相互污染。洗滌時將板子翻轉(zhuǎn)并將液體甩掉拍凈。洗滌液中含有 0.05%吐溫-20 以抑制非特異性結(jié)合。如果實(shí)驗(yàn)過程中斷，應(yīng)該將酶標(biāo)板中加入洗滌液以避免酶標(biāo)板干燥。

　　4.3.3HRP 標(biāo)記抗體

　　HRP 標(biāo)記的抗體作為檢測抗體，與底物反應(yīng)后，使底物顯色。實(shí)驗(yàn)過程中避免接觸疊氮na，疊氮na可使 HRP 失活。

　　4.3.4 底物

　　使用 TMB 底物，一般來說，產(chǎn)生的顏色與待測物呈正比。

　　4.3.5 對照和標(biāo)本

　　每次實(shí)驗(yàn)都要包含適當(dāng)?shù)膶φ找杂糜诜治鰴z測體系的效能。定量 ELISA 要以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。每次實(shí)驗(yàn)要設(shè)以下對照：

　　4.3.6 本底對照：不加標(biāo)本，其它試劑都加，可以幫助分析非特異性本底的原因。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果減去本底以保證實(shí)驗(yàn)之間的可比性。

　　4.3.7 陰性對照：加已知的陰性參考品。

　　4.3.8 閾值對照：加弱陽性參考品用于確定陽性的臨界值。

　　4.3.9 陽性對照：加強(qiáng)陽性參考品以確定最大線性信號。

　　對照和標(biāo)本都用 BSA 稀釋/封閉液進(jìn)行稀釋以保證本底，所有實(shí)驗(yàn)最好做雙份。

　　5.試劑配制

　　所有試劑當(dāng)日配制

　　5.1 1X 包被液：用蒸餾水稀釋濃縮洗滌液(1ml 濃縮包被液+9ml 蒸餾水)

　　注意：如果在 10X 中出現(xiàn)結(jié)晶，加熱到室溫或 37°C混勻并再溶解。

　　5.2 1X BSA 稀釋/封閉液:

　　雜交瘤篩選：稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液(2ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+8ml 蒸餾水)

　　其它檢測：稀釋濃縮 BSA 稀釋/封閉液(5ml 濃縮 BSA 稀釋/封閉液+45ml 蒸餾水)

　　注意：如果在 10X 中出現(xiàn)結(jié)晶，加熱到室溫或 37°C混勻并再溶解。

　　5.3 1X 洗滌液：

　　濃縮洗滌液 20 倍稀釋(15ml 濃縮洗滌液+285ml 蒸餾水)。稀釋的洗滌液室溫穩(wěn)定至少

　　6 個月。

　　5.4 二抗工作液：

　　二抗?jié)饪s液濃度為 0.1mg/ml，2～8°C穩(wěn)定至少 1 年，使用前用 1X BSA 稀釋/封閉液稀釋，對大多數(shù)實(shí)驗(yàn)而言，0.1～2.0μg/ml 工作濃度。

　　5.5 TMB 顯色液：直接使用。

　　5.6 終止液：直接使用

　　5.7 標(biāo)本：

　　5.8 對照

　　6.實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

　　通過 3 個變量來優(yōu)化 ELISA 條件: 試劑濃度、溫度、孵育時間。一般情況下，室溫反應(yīng)對大多數(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻玫胶芎玫慕Y(jié)果。

　　優(yōu)化不同試劑濃度和不同孵育時間，選擇最佳的實(shí)驗(yàn)條件。在優(yōu)化最佳濃度時，第一個試劑倍比稀釋，然后第二個試劑倍比稀釋，每一孔都對應(yīng)于第一個試劑和第二個試劑的某一個稀釋度的組合。棋盤滴定確定試劑的最佳濃度

　　1.加 100μl 稀釋液到 2～12 列的每孔。

　　2.加 200μl 稀釋的試劑到第一列的每孔中。

　　3.從第 1 列的孔中取 100μl 轉(zhuǎn)移到第二孔中，混勻用槍吹吸 3～5 次。

　　4. 重復(fù)步驟 3 向后稀釋，一直到第 11 列，吸取第 11 列 100μl 棄去， 第 12 列作為對照。

　　重復(fù)以上的操作，從 A 排至 G 排, 稀釋第二個試劑，H 排作為對照。

　　7.操作步驟

　　7.1 雜交瘤篩選

　　包被液：在 1×包被液中稀釋抗原至合適的濃度(一般 1～10μg/ml)。

　　一抗工作液：含有單克隆抗體的培養(yǎng)液。

　　二抗工作液：取 25μl 的酶標(biāo)二抗稀釋到 5.0 ml 1X BSA 的稀釋/封閉液中

　　7.1.1 包被抗原

　　1. 加抗原到酶標(biāo)板中。

　　2. 室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.1.2 封閉酶標(biāo)板

　　1.加 150 uL 1X BSA 稀釋/封閉液到每孔中。

　　2. 孵育 5-15 分鐘, 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.1.3 與含單克隆抗體的培養(yǎng)液反應(yīng)

　　1.每孔中加 50 uL 含單克隆抗體的培養(yǎng)液。

　　2. 室溫反應(yīng) 1 小時.

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.1.4 洗板

　　1. 加入 1X 洗滌液。

　　2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　3. 重復(fù) 3～5 次。

　　7.1.5 加二抗

　　1. 每孔加 50 uL 二抗。

　　2. 室溫反應(yīng) 1 小時。e.

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液，洗板。

　　4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.1.6 顯色反應(yīng)

　　1. 每孔加 50 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。

　　2. 每孔加 50ul 終止液。

　　3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

　　7.2 直接 ELISA

　　抗原包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。

　　酶標(biāo)抗體：稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。

　　7.2.1 加抗原

　　1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μ抗原包被液。

　　2.室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.2.2 封閉

　　1. 每孔加 300μ1X BSA 稀釋/封閉液。

　　2. 反應(yīng) 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.2.3 加酶標(biāo)抗體

　　1. 每孔加入 100 μl 酶標(biāo)抗體。

　　2. 室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.2.4 洗板

　　1. 加入 1X 洗滌液。

　　2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　3. 重復(fù) 3～5 次。

　　4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.2.5 顯色反應(yīng)

　　1. 每孔加 50 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。

　　2. 每孔加 50ul 終止液。

　　3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

　　7.3 間接抗體 ELISA

　　抗原包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。

　　一抗/二抗工作液：將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。

　　7.3.1 加抗原

　　1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μ抗原包被液。

　　2.室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.3.2 封閉

　　1. 每孔加 300μl 1X BSA 稀釋/封閉液。

　　2. 反應(yīng) 5～15 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.3.3 加一抗

　　1. 每孔中加入 100μl 一抗

　　2. 室溫反應(yīng) 1 小時

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.3.4 洗板

　　1. 加入 1X 洗滌液。

　　2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　3. 重復(fù) 3～5 次。

　　7.3.5 加二抗

　　1. 每孔加入 100μl 酶標(biāo)二抗。

　　2. 室溫孵育 1 小時。

　　3. 重復(fù) 3～5 次。

　　4. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.3.6 顯色反應(yīng)

　　1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。

　　2. 每孔加 100ul 終止液。

　　3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

　　7.4 雙抗體夾心 ELISA

　　包被液：將抗原稀釋在 1X 包被液中，濃度 1～10μg/ml。

　　抗原標(biāo)本：將抗原標(biāo)本稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中。

　　二抗工作液：將抗體稀釋到 1X BSA 稀釋/封閉液中，稀釋度參考條件優(yōu)化方法。

　　7.4.1 加捕獲抗體

　　1. 在酶標(biāo)板中每孔加入 100μ抗體包被液。

　　2.室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.4.2 封閉

　　1. 每孔加 300μl 1X BSA 稀釋/封閉液。

　　2. 反應(yīng) 5～15 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.4.3 加抗原

　　1. 每孔中加入 100μl 標(biāo)本液

　　2. 室溫反應(yīng) 1 小時直至過夜。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.4.4 洗板

　　1. 加入 1X 洗滌液。

　　2. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　3. 重復(fù) 3～5 次。

　　7.4.5 加標(biāo)記抗體1. 每孔加入 100μl 標(biāo)記。

　　2. 室溫孵育 1 小時。

　　3. 甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　4. 重復(fù) 3～5 次。

　　5. 最后一次浸在洗滌液中 5 分鐘，甩掉板中液體并拍凈殘液。

　　7.4.6 顯色反應(yīng)

　　1. 每孔加 100 uL 底物，室溫反應(yīng) 15 分鐘。

　　2. 每孔加 100ul 終止液。

　　3. 測 OD 值，檢測波長 450nm。

　　8.可能出現(xiàn)的問題和解決辦法

　　8.1 以下結(jié)果表示實(shí)驗(yàn)有效：

　　陰性對照：無色

　　背景對照：OD 值低于 0.2

　　閾值對照：中度顯色

　　強(qiáng)陽性對照：深度顯色，OD≥1.0

　　8.2 希望增加特異性信號

　　1. 增加酶標(biāo)抗體的濃度或延長孵育時間或提高孵育溫度。

　　2. 延長底物的孵育時間。

　　3. 增加包被抗原濃度或延長孵育時間。

　　4.用純化的抗原。

　　5. 封閉時間縮短或增加 BSA 稀釋/封閉液的稀釋度。

　　6. 減少洗板次數(shù)或操作更輕柔。

　　8.3 減少非特異性信號

　　1.減少包被抗原濃度或縮短孵育時間。

　　2.減少酶標(biāo)抗體的濃度或縮短孵育時間或降低孵育溫度。

　　3.縮短底物的孵育時間。

　　4.增加洗板次數(shù)或延長洗滌液浸泡時間。

　　5.通過加低濃度包被抗原或捕獲抗體到稀釋的酶標(biāo)物中以減少結(jié)合物的交叉反應(yīng)。

　　8.4. 背景忽高忽低，檢查洗板機(jī)功能是否正常。