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　　知識分享：BUNSEN本生冷凍管的使用要點及安全建議

　　冷凍管的使用要點：

　　冷凍管是一種用于低溫保存樣品的實驗管。常用規(guī)格有0.5ml、1.8ml、5ml、10ml等。冷凍管使用不當會引起冷凍管爆炸，導(dǎo)致危險物質(zhì)泄漏，嚴重時甚至會造成人身傷害。

　　冷凍管也叫菌種保存管。微生物實驗室常用的細菌保存方法有牛奶法、甘油法、斜面法等。復(fù)雜程度不同，效果也大不相同。目前國內(nèi)大部分實驗室，實驗人員自己制作細菌保存管，不僅增加了工作強度，而且由于各種條件的限制，也不能總是令人滿意。

　　1、需要在生物安全柜內(nèi)操作，要保證操作的無菌性，確保菌種不被污染。

　　2.冷凍管內(nèi)的小瓷珠顏色可能有所不同，并不意味著任何產(chǎn)品都有不同的功能，而是方便用戶對細菌進行編碼和標記。

　　3.接種前，因下列情況不得使用冷凍管：

　　A.瓶子出現(xiàn)漏液的情況。

　　B.冷凍管內(nèi)的凍存保護液混濁(表示已被污染)。

　　C.超過有效保質(zhì)期。

　　4.小瓷珠一旦從冷凍管中取出，不得以任何理由放回冷凍管中。

　　5.丟棄用過或部分用過的冷凍試管時，應(yīng)注意防止生物危害。

　　冷凍管的使用步驟：

　　1.從細菌的純培養(yǎng)物中挑選新鮮培養(yǎng)物，制備濁度約為3-4麥克斯韋比的細菌懸液，并接種到菌種儲存管中。

　　2.擰緊儲存管，來回轉(zhuǎn)動4-5次，使細菌乳化，不晃動。

　　3.將儲存管儲存在-20-70的冰箱中。

　　1.使用低溫恒溫器儲存樣品時，嚴格要求低溫恒溫器應(yīng)儲存在液氮的氣相中或冰箱中!如果將冷凍管保存在液氮中，液氮會以一定概率滲入冷凍管內(nèi)，復(fù)蘇時由于液氮氣化，管內(nèi)外壓力不平衡，容易造成冷凍管爆裂，具有生物危害性。

　　2.操作冷凍管復(fù)蘇，全程使用安全防護設(shè)備。建議穿實驗服，戴棉手套，在安全的實驗臺上操作。如有可能，請佩戴護目鏡或防護面罩。請格外小心，因為夏天的室內(nèi)溫度會比冬天高。

　　3.冷凍管廠家認為在冷凍保存細胞的儲存過程中，冷凍管的冷凍溫度需要均勻。凍結(jié)不均勻會導(dǎo)致冰塞的產(chǎn)生，冰塞會壓制兩側(cè)液體的溫度傳遞，進而產(chǎn)生危險的高壓，損壞冷凍管。

　　4.冷凍樣本量不應(yīng)超過冷凍儲存管所需的工作體積。

　　冷凍管廠家認為細胞的冷凍保存過程;

　　1.用預(yù)熱的PBS沖洗細胞。棄去PBS后，加入含有EDTA的胰蛋白酶消化液消化細胞(消化液可以薄薄地覆蓋細胞表面，消化液的濃度要根據(jù)不同的細胞系進行調(diào)整)。

　　2.在37度的消化細胞3-5分鐘，不要過度消化。

　　3.一旦細胞從底部分離出來，可以用含血清的培養(yǎng)基停止消化，用吸管輕輕吹氣，細胞就可以重新懸浮。

　　4.冷凍管廠家認為離心細胞再懸浮以沉淀細胞，棄去上清液，并用含血清的培養(yǎng)基再懸浮細胞沉淀。

　　5.計數(shù)細胞(建議使用紐鮑爾室)。

　　6.離心(500 g，5分鐘)細胞再懸浮并丟棄上清液。用適當體積的含血清培養(yǎng)基懸浮細胞。

　　7.將細胞重懸液與冷凍保存液(60%培養(yǎng)基，20%流式細胞儀，20%二甲基亞砜)以1，333，601的比例混合，然后轉(zhuǎn)移到冷凍管中。冷凍試管中的細胞濃度應(yīng)為15106個細胞/毫升。

　　8.冷凍管廠家認為含有細胞的冷凍管應(yīng)以1 K/min的冷卻速度冷凍。上述要求可通過將冷凍管插入裝有異丙醇的冷凍箱室中，并將其放入70的冰箱中來實現(xiàn)。如果冷凍溶液中有其他類型的樣品，冷凍管應(yīng)直接在20、70或液氮的氣相中冷凍。為了保證每個樣品的冷凍效果均勻，4毫升和5毫升的Cryo.s管需要在20冷凍過夜，然后轉(zhuǎn)移到70或液氮的氣體層。

　　9.然后將冷凍儲存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中。為了避免污染(如支原體)并考慮安全預(yù)防措施的要求，建議將Cryo.s冷凍管放置在液氮上方的氣體層中，而不是液氮層中。

　　冷凍管廠家認為細胞復(fù)蘇過程：

　　1.從液氮罐中取出冷凍管后，立即放入37的水浴中解凍，解凍時間約為1-2分鐘。解凍時，需要不斷搖動冷凍管，使其盡快融化。這一步解凍過程越快越好。

　　2.冷凍管廠家認為將解凍后的細胞懸液轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，需要立即加入一定量的含血清培養(yǎng)基進行混合。

　　3.離心(500 g，5分鐘)細胞再懸浮并丟棄上清液。用適當體積的含血清培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀，然后將其分裝到一個或多個細胞培養(yǎng)瓶中。

　　4.請遵循細胞接種的推薦濃度。

　　5.在接下來的12小時內(nèi)，細胞需要在靜止狀態(tài)下培養(yǎng)。

　　6.冷凍管廠家認為細胞更換可在24-48小時后進行。

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